خوش آمدید

جستجو

تبلیغات





روش کشت و رنگ آمیزی باکتری های اسید لاکتیک

     

    بسم الله الرحمن الرحیم

     

    روش کشت لاکتوباسیلوس های ماست و رنگ آمیزی آن

     

    تهیه کننده و گردآورنده:یوسف سهرابی

    دانشگاه علوم پزشکی تبریز

    دانشکده تغذیه 

    مقدمه.

    اسیدلاکتیک باکتری ها

    موارد استفاده از باکتری‌های اسید لاکتیک.

    انتخاب نمونه و نمونه برداری از ماست...

    رقت سازی نمونه.

    تهیه محیط کشت...

    اتوکلاوگذاری محیط کشت...

    کشت پور پلیت...

    شمارش کلونی ها:

    روش محاسبه:

    رنگ آميزی گرم.

    روش کار.

     

     

     

     

     

     

     

     

    مقدمه

     

    تولید بسیاری از محصولات غذایی و همچنین ویژگی های خاص بسیاری از مواد غذایی ناشی از فعالیت تخمیری میکروارگانیسم ها میباشد بسیاری از مواد غذایی مثل ماست، پنیر، خیارشور، و سوسیس های تخمیری از جمله محصولاتی هستند که زمان ماندگاری آنها نسبت به مواد خامی که از آنها تهیه میشود ماندگاری بیشتری دارند تمام محصولات تخمیری علاوه بر داشتن ماندگاری بیشتر، دارای ویژگی های طعمی و عطری هستند که به طور مستقیم یا غیر مستقیم به میکروارگانیسم های تخمیر کننده مربوط میشود.

    انواع میکروارگانیسم ها که تولید اسید میکنند در طبیعت، خاک، فراورده های کشاورزی خام و بعضی از مواد غذایی فرایند شده وجود دارد یکی از مهمترین این ارگانیسم ها در صنایع غذایی، باکتری های ایجاد کننده اسید لاکتیک میباشد این ارگانیسم ها اغلب اسید لاکتیک و تولید اروما درصنایع غذایی به خصوص در ماست میشود  هرگاه اسیدیته یگ محصول برای رشد باکتری ها مناسب بوده و و قندهای ساده نیز به فراوانی وجود داشته باشد انتظار میرود اسید لاکتیک باکتری ها رشد کنند

    اسیدلاکتیک باکتری ها

    این باکتری ها گرم مثبت، کاتالاز منفی، و میله ای شکل بوده و اغلب به صورت زنجیره های بلند دیده میشود. اگرچه انواع موجود در مواد غذایی میکروائروفیل هستند ، بسیاری از نژادهای بیهوازی واقعی نیز در روده وجود دارد . و در فراورد های لبنی میتوان یافت.

    این باکتری‌هار بر اساس  و مشخصات فیزیکیشان دسته بندی می‌شوند. این باکتریها در گیاهان بیشتر به عنوان تجزیه کننده‌ها حضور دارند و در کل محصولات دارای لاکتیک اسید را تجزیه می‌کنند و طی فرایند تخمیر کربو هیدراتها لاکتیک اسید را به عنوان محصول نهایی تولید می‌کنند. در حال حاضر این گروه شامل 13 جنس از باکتری های گرم مثبت میباشد :کارنوباکتریوم(Carnobacterium)، انتروکوکوسentrococos، لاکتوکوکوس، لاکتوباسیلوسlactobasilus، لاکتوسفائرا، لوکونوستوک(Leuconostoc)، اونوکوکوس((Oenococcus، پدیوکوس(Pediococcus)، پارالاکتوباسیلوسparalactobasilus، استرپتوکوکوسstreptococos، تتراجنوکوکوس(Teragenococcus)، واگوکوس Vagococcus و ویسلا Weisella.

    موارد استفاده از باکتری‌های اسید لاکتیک

    گروه عمده‌ای از باکتری‌های اسید لاکتیک به ویژه لاکتو باسیل‌ها ضمن فواید متعدد تکنولوژیکی و توانایی بالقوه در ایجاد عطر و طعم قادر به بقا و رشد در سیستم گوارشی انسان بوده و اثرات مفیدی بر سلامتی مصرف کنندگان دارند. این گونه باکتری‌ها و دیگر میکروارگانیسم‌هایی که چنین ویژگی داشته باشند تحت عنوان پروبیوتیک تعریف می‌شوند. امروزه با توجه به آگاهی و تمایل روزافزون مصرف کنندگان به خرید محصولات سالم تر و مفیدتر، توسعه فراورده‌های پروبیوتیکی در صنعت از اهمیت زیادی برخوردار است در این میان محصولات لبنی حاملهای بسیار مطلوبی برای پروبیوتیک‌ها محسوب می‌شوند امروزه شیرهای تخمیری مانند ماست بیشترین فراورده‌های لبنی حاوی باکتری‌های پروبیوتیک را تشکیل می‌دهند البته دیگر فراورده‌ها مانند شیر شیرین شده پنیر بستنی و شیر خشک را نیز می‌توان به عنوان حامل بکار برد. یکی از مزایای عمده استفاده از فراورده‌های شیری غیر تخمیری عدم وجود محصولات نهایی تخمیر در محیط می‌باشد که بر بقاء پروبیوتیک‌ها تاثیر منفی می‌گذارند. در مرحله انتخاب سوش‌های میکروبی علاوه بر ویژگی پروبیوتیکی نکات مهم دیگری مانند تناسب میکروارگانیسم برای رشد و فرآوری در یک کشت تغلیظ شده، رشد و بقا در محصولات تولیدی و تاثیر آنها بر ویژگی‌های حسی را نیز باید مورد توجه قرار داد. قابلیت بقا معمولاً برای فرا ویژگی بهینه به عنوان پیش نیاز در نظر گرفته می‌شود، به این دلیل تضمین کیفیت فراورده‌های پروبیوتیکی اغلب بر اساس تکنیک‌های شمارش سلول‌های زنده صورت می‌گیرد. عوامل متعددی مانند ویژگی‌های سوش‌های میکروبی ماتریکس غذایی، دما، pH و اثر متقابل میکروارگانیسم‌ها بر زنده مانده پروبیوتیک‌ها تاثیر می‌گذارد. مواد مورد استفاده در بسته بندی و شرایط نگهداری فراورده‌ها اهمیت زیادی در کیفیت نهایی محصول دارند. پری بیوتیک‌ها (کربو هیدرات‌های قابل تخمیر - غیرقابل هضم) نیز ممکن است نقش مطلوبی در ثبات پروبیوتیک‌های انتخابی داشته باشند از سویی دیگر با توجه به ضرورت بقاء پروبیوتیک‌ها در دستگاه گئارشی انتخاب سوش‌ها بر اساس مقاومت به شرایط اسیدی و غلظت زیاد اسیدهای صفراوی انجام می‌گیرد.

    انتخاب نمونه و نمونه برداری از ماست

    ابتدا یک سطل ماست سنتی یک کیلو گرمی از مغازه لبنیاتی تهیه کردیم و بعد آنرا به آزمایشگاه اوردیم ماست از شیر گاو  یک روز قبل از آزمایش تولید شده بود  از نمونه مورد نظر مقدار 25 گرم در ترازوی حساس وزن کردیم و آن را در کیسه وریزر ریختیم و سپس از آّب مقطر که قبلا تهیه شده بود مقدار 225 سی سی در میژور اندازه گرفته و به داخل نایلون فریزر ریختیم

    نایلون فریزر که حاوی نمونه و آّب مقطر است را در داخل دستگاه استومچر قرار میدهیم از روی دستگاه استومچ زمان یک دقیقه و 260 دور در دقیقه را تنظیم میکنیم و دکمه استارت را میزنیم

    بعد یک دقیقه نمونه را از دستگاه خارج میکنیم (چون نمونه ما مایع نبود پس باید به خوبی همگن شود و برای همگن شدن ازدستگاه استومچر استفاده میکنیم ، این دستگاه ضربات و پشت سرهم به نایلون وارد میکند و نمونه را به صورت همگن در می آورد). سپس نمونه را در لوله آزمایش میریزیم

    گفتنی است چون ما 25گرم ماست را در 225 گرم آب مقطر حل کردیم پس رقت ما10-1  است.

    رقت سازی نمونه

    ابتدا 10 عدد لوله آزمایش را در جالوله ای قرار میدهیم و سپس از رقت 10 -1را در لوله اولی میریزیم. برای تهیه رقت 10-2 یک میلی لیتر با پیپت استریل از رقت 10 -1را برداشت نموده و تحت شرایط استریل در لوله آزمایش حاوی 9 میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل ریخته و مخلوط مینمائیم

    برای تهیه رقت10 -3 از رقت 10 -2 مانند قبل یک میلی لیتر برداشته و داخل لوله حاوی 9 میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل میریزیم  و مخلوط میکنیم، در صورت نیاز به رقت بالاتر مانند فوق از رقت ماقبل، 1 میلی لیتر برداشته و داخل لوله 9 میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل میریزیم. بهتر است برای یکنواخت شدن نمونه لوله ها را به مدت15 ثانیه در شیکر لوله قرار گیرد.به این ترتیب رقت ها را تا غلظت 10 -10  میرسانیم .

    تهیه محیط کشت

    برای کشت باکتری های اسید لاکتیک از محیط کشت MRS  آگار استفاده میکنیم

    MRSحاوی موارد زیر است

    Pepton

    Meat extract

    Yeast extract

    D glucose

    Dipotassium hydrogen phosphate

    Sodium acetate trihydrate

    Ammonium sitrate

    Magnesium sulphate heptahydrate

    Magnesium sulphate tetrahydrate

     

    ابتدا یک کاغذ بر روی ترازو میگذاریم و  ترازو را صفر میکنیم سپس مقدار5.1  گرم از محیط کشت را بر روی کاغذ ریخته و وزن میکنیم

    سپس محیط کشت را برروی ارلن میریزیم و روی آن مقدار 100 سی سی از آب مقطر استریل میریزم و آن را روی شعله غیر مستقیم آتش میگذاریم  و صبر میکنیم تا محیط کشت به جوش بیاید بعد از جوشیدن آنرا از روی شعله با دستکش برمیداریم

     

    اتوکلاوگذاری محیط کشت

     

    میحط کشت جوشیده شده را به دستگاه اتوکلاو انتقال میدهیم و در آن که حاوی پیچ هایی است به صورت موازی میبندیم و دکمه استارت را دو بار میزنیم و سپس آب معمولی به مخزن دستگاه میریزیم تا چراغ آن ابی شود و هروقت رنگ آن آبی شود دیختن آب را متوقف میکنیم  دستگاه اتوکلاو با فشار یک و نیم بار و دمای 121  به مدت زمان 15 دقیقه قرار میدهیم و بعد از 15 دقیقه دستگاه به صورت اتوماتیک خاموش میشود.

    سپس بخار اتوکلاو را باز میکنیم و چند دقیقه صبر میکنیم تا بخار آن به طور کامل خارج شودو سپس درب دستگاه را باز میکنیم و محیط کشت را به دمای محیط آزمایشگاه انتقال میدهیم تا دمای آن به دمای محیط میرسیم  و سپس کشت پور پلیت را روی انجام میدهیم.

    کشت پور پلیت  

    توسط سمپلر مقدار معینی ( 1 cc ) از هر رقت را درون پلیت ریخته و دمای محیط کشت  MRS آگار را نیز درون پلیت ها می ریزیم ( 15cc ). به این روش کشت کلونی ها روش پور پلیت می گویند.( باید دقت داشت که دمای محیط کشت  MRS  آگار از 45 درجه سانتیگراد بیشتر نباشد زیرا در غیر این صورت بر اثر حرارت محیط ، باکتری ها آسیب دیده و کلونی تشکیل نمی شود). برای مخلوط شدن محیط کشت با نمونه آلوده باید پلیت را 5 بار در جهت عقربه های ساعت و 5 بار برخلاف آن و 5 بار افقی و 5 بار عمودی پلیت را تکان دهیم یا پلیت را 5 بار به صورت هشت انگلیسی حرکت می دهیم. این کار اهمیت خاصی دارد زیرا اگر این کار به خوبی انجام نشود پراکندگی کلونی ها پس از رشد در پلیت نامنظم خواهد بود. پلیت ها را در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت قرار داده و بعد رشد کلونی ها آنها را با دستگاه کلونی کانتر شمارش می کنیم.

    برای اطمینان از استریل بودن محیط کشت و پلیت ها از محیط کشت شاهد استفاده می کنیم. در ضمن برای هر رقت باید دو پلیت آماده شود.

    شمارش کلونی ها:

    دو روش برای شمارش کلونی ها وجود دارد:

    الف) دستگاه کلونی کانتر که به طور اتوماتیک تعداد کلونی ها را در یک رقت مشخص نشان می دهد.

    ب) روش دستی که پلیت را به صورت وارونه بر روی یک صفحه سفید یا سیاه قرار داده و بین پلیت و صفحه یک شیشه شطرنجی قرار دارد و با علامت گذاری خانه ها تعداد را بدست می آوردند.

    روش محاسبه:

    الف) شمارش کلی میکروبی ( محاسبه استاندارد)← جهت شمارش پلیت هایی انتخاب شوند که بین 30 تا 300 کلونی داشته باشند که برابر میانگین تعداد کلونی های شمارش شده در دو پلیت ضرب در ضریب رقت بکار رفته.

    ب) محاسبه تخمینی← اگر در تمام رقت ها بیش از 300 کلونی در هر پلیت دیده شود ، سطح هر پلیت را به شعاع های مناسب تقسیم می کنیم و کلونی ها را در یک قسمت شمارش کرده و سپس تعداد کل را در ضریب مناسب ضرب می کنیم. میانگین شمارش را در دو پلیت محاسبه و در ضریب رقت ضرب و نتیجه را به عنوان تخمین شمارش کلونی گزارش می کنند.

     به دلیل زیاد بودن کلنی ها تعداد کلنی ها قابل شمارش نبود

    رنگ آميزی گرم

    اين نوع رنگ آميزی مرکب برای تشخيص دو گروه باکتری های گرم مثبت و گرم منفی به کار می رود. اساس رنگ آميزی گرم اختلاف ترکيبات ديواره سلولی باکتری ها است.

    مواد و وسايل مورد نياز

    ü    لام آزمايشگاهی

    ü    لوپ يا حلقه کشت

    ü    تشتک رنگ آميزی

    ü    چراغ گازی

    ü    رنگ های کريستال ويوله و سافرانين

    ü    محلول لگول

    ü    محلول استن

    ü    میکروسکوپ نوری

     

     

    روش کار

     

     ابتدا از کلنی باکتری های مورد نظر برداشت کرده و به روشی که در پيش گفته شد گستره خشک بر روی لام تهيه کردیم. گستره را با خشک کن خشک کرده و با ۳ بار عبور دادن از روی شعله بر روی لام ثابت کردیم.

    سطح گستره را با رنگ کريستال ويوله بپوشانيد و ۱ دقيقه صبر کنيد تا رنگ جذب سلول شود.

     پس از ۱ دقيقه لام را شستیم.

     سطح گستره را به مدت ۱ دقيقه با لوگول میپوشانیم .

    يادآوری: نقش لوگول، تثبيت رنگ کريستال ويوله در ديواره سلول باکتری ها است (نقش دندانه دارد).

     پس از ۱ دقيقه لام را با آب شستشو شستیم.

     سپس با الکل استن به مدت ۳۰ ثانيه رنگ بری کردیم.

    يادآوری: الکل استن نقش رنگ بری برای رنگ کريستال ويوله دارد. اختلاف باکتری های گرم مثبت و گرم منفی در همين مرحله است. (به قسمت بيشتر بدانيم توجه کنيد.)

    هنگام استفاده از الکل استن بهتر است لام را به صورت کج نگه داشتیم و الکل استن را به آرامی به مدت ۳۰ ثانيه از بالای لام روی آنریختیم

    سطح گستره را با رنگ سافرانين به مدت ۱ دقيقه پوشاندیم.

    پس از ۱ دقيقه لام را با آب شستیم.

    و در آخر لام را خشک کرده و با ميکروسکوپ نوری و عدسی 100 ، نمونه را مشاهده کردیم.

    که نمونه های ما به دلیل گرم مثبت بودن بفش مشاهده شد.

     


    این مطلب تا کنون 34 بار بازدید شده است.
    منبع
    برچسب ها : پلیت ,محیط ,نمونه ,کلونی ,باکتری ,دستگاه ,اسید لاکتیک ,میلی لیتر ,شمارش کلونی ,مواد غذایی ,دمای محیط ,دستگاه کلونی کانتر ,فیزیولوژی استریل میریزیم ,
    روش کشت و رنگ آمیزی باکتری های اسید لاکتیک

تبلیغات


    محل نمایش تبلیغات شما

پربازدیدترین مطالب

آمار

تبلیغات

محل نمایش تبلیغات شما

تبلیغات

محل نمایش تبلیغات شما

آخرین کلمات جستجو شده

تگ های برتر